ELISA實(shí)驗(yàn)中制備抗體酶結(jié)合物的常用方法

　　酶標(biāo)記的抗原或抗體稱為結(jié)合物。抗原由于化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，可用不同的方法與酶結(jié)合。如蛋白質(zhì)抗原，基本上可參考抗體酶標(biāo)記的方法。ELISA制備抗體酶結(jié)合物的方法通常有以下幾種。

　　1.戊二醛交聯(lián)法

　　戊二醛是一種雙功能團(tuán)試劑，可以使酶與蛋白質(zhì)或者其他抗原的氨基通過它而偶聯(lián)。戊二醛交聯(lián)可用一步法（如連接AP），也可用二步法（如連接HRP）。舉例如下：2mg~5mg純抗體與5mgAP混合與0.1mol/LpH6.8的磷酸緩沖液1mL中，4℃下對(duì)相同緩沖液透析平衡。磁力攪拌下，緩慢加入1%戊二醛0.05mL，在室溫下放置2h。在4℃下對(duì)0.05mol/LpH8.0Tris緩沖液透析平衡，即得酶標(biāo)抗體。辣根過氧化酶可溶解于50%飽和度硫酸銨中。用上法交聯(lián)后可用50%飽和度硫酸銨沉淀酶標(biāo)抗體，棄去上清中游離酶。戊二醛一步法操作簡(jiǎn)單、有效，而且重復(fù)性好。缺點(diǎn)是交聯(lián)時(shí)分子間的比例不嚴(yán)格，大小也不一，影響效果。制備HRP抗體結(jié)合物也可用二步法，即先將HRP與戊二醛作用，透析除去戊二醛，在pH9.5緩沖液中再與抗體作用而形成酶標(biāo)抗體。此法的效率可高于一步法10倍左右。

　　2.過碘酸鹽氧化法

　　本法只用于HRP的交聯(lián)。該酶含18%碳水化合物，過碘酸鹽將其分子表面的多糖氧化為醛基。用硼酸氫鈉中和多余的過碘酸。酶上的醛根很活潑，可與蛋白質(zhì)結(jié)合，形成摩爾比例結(jié)合的酶標(biāo)結(jié)合物。有人認(rèn)為此法為辣根過氧化酶交聯(lián)的有效的方法。但也有人認(rèn)為由于所有試劑較為劇烈，各批實(shí)驗(yàn)結(jié)果不易重復(fù)。

　　按以上的方法制備的結(jié)合物一般混有未結(jié)合的酶和抗體。理論上結(jié)合物中混有游離酶不影響ELISA中后的酶活性測(cè)定，因經(jīng)過洗滌，非特異性吸附于固相上的游離酶已被洗去。但游離的抗體則會(huì)與酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)相應(yīng)的固相抗原，因而減低結(jié)合到固相上的酶標(biāo)抗體量。因此制備的結(jié)合物應(yīng)予以純化。純化的方法較多，分離大分子混合物的方法均可應(yīng)用。硫酸銨鹽析法操作簡(jiǎn)單，但效果不如用SephadexG-200凝膠過濾的好。